Elettroforesi su gel a gradiente modificato

Principio

Molecole di DNA a doppio filamento Quando un'elettroforesi su gel di poliacrilammide generale, il suo comportamento di migrazione è determinato dalla sua dimensione molecolare e carica. È possibile distinguere frammenti di DNA di lunghezza diversa, ma il frammento di DNA della stessa lunghezza è lo stesso del comportamento di migrazione nella colla, quindi non può essere distinto. La tecnologia DGE / TGGE viene aggiunta al gel di poliacrilammide generale, che viene aggiunto al gradiente dell'agente denaturante (urea e formammide), distinguendo così la stessa lunghezza ma viene separato il frammento di DNA di sequenza diversa. Un particolare frammento di DNA ha la sua sequenza unica, la sua composizione di sequenza determina il suo dominio di sblocco, MD) e il comportamento di fusione. Alcune centinaia di paia di basi di frammenti di DNA hanno tipicamente diverse regioni non localizzate, ciascuna delle quali ha una coppia di basi continua (Fig. 1). Quando la concentrazione in gradi aumenta gradualmente la concentrazione della regione di soluzione più bassa, il segmento di questa regione è soggetto a una coppia di basi ripristinata. Queste regioni sono sequenzialmente limitate quando la concentrazione di ogni altra regione di decadimento viene raggiunta in sequenza. Fino a quando la concentrazione degenerativa non ha raggiunto la soluzione più alta fino alla concentrazione della regione della soluzione più alta, anche l'area del bagno più alta risolve la catena, risolvendo così completamente il DNA a doppio filamento.

Diverso frammento di DNA a doppio filamento

Diversi frammenti di DNA a doppio filamento sono diversi a causa della loro composizione di sequenza, quindi la regione di sblocco della zona non convenzionale e ciascuna delle aree di decomposizione sono diverse. Di. Quando eseguono DGGE, il grado di densità dell'agente è relativamente piccolo e non è possibile creare la regione decimale minima del frammento di DNA a doppio filamento e il comportamento di migrazione del frammento di DNA è allo stesso modo del gel di poliacrilammide generale. Tuttavia, una volta che la concentrazione denaturante raggiunge la più alta temperatura della regione di soluzione del frammento di DNA, il frammento di DNA è completamente risolto per diventare una molecola di DNA a singolo filamento e possono continuare a migrare nella colla. Pertanto, se la differenza di sequenza tra i diversi frammenti di DNA si verifica nell'area di soluzione più alta, questi segmenti non possono essere distinti. Questo problema può essere risolto aggiungendo un frammento di DNA ricco di GC (clip GC, generalmente 30-50 paia di basi) a un'estremità del frammento di DNA. L'area di soluzione più alta contenente il frammento di DNA della clip GC si trova nella sequenza della clip GC, la sua concentrazione di soluzione è elevata e si può impedire che il frammento di DNA si risolva completamente nella gomma DGGE. Quando viene aggiunta la clip GC, le differenze di sequenza nel frammento di DNA possono essere scartate. Tuttavia, una volta che il frammento di DNA migra in una posizione specifica, la concentrazione del degeneratore è solo il declino nella diminuzione della regione di decadimento minimo del frammento di DNA a doppio filamento e si verifica immediatamente la regione di soluzione minima del frammento di DNA a doppio filamento. Il tasso di migrazione del frammento di DNA in parte del frammento di DNA parzialmente decomposto diminuirà drasticamente. Pertanto, la stessa lunghezza, i frammenti di DNA della sequenza, raggiungeranno la concentrazione in soluzione delle rispettive regioni minime di sblocco in diverse posizioni nella colla, quindi avranno una catena parzialmente decrescente in diverse posizioni nella colla. La colla si distingue.

Caratteristiche

DGGE / TGGE è stato ampiamente utilizzato per analizzare la biodiversità di batteri, batteri blu, batteri, comunità microeucariotiche, eucariotiche e virali in ambienti naturali [8]. Questa tecnologia può fornire informazioni di tipo vantaggioso nelle comunità e analizzare contemporaneamente più campioni, che hanno le caratteristiche di ripetibilità e facilità d'uso, adatti per il rilevamento dei cambiamenti spaziali nelle popolazioni, e possono ibridarsi a sonde specifiche mediante analisi di sequenza o con sonde specifiche Comunità di identificazione dell'analisi composizione. DGGE e TGGE hanno rispettivamente la stessa lunghezza della stessa lunghezza, ma solo un frammento di base del frammento di DNA è separato dal gradiente degenerativo chimico gradualmente aumentato e dal gradiente di temperatura lineare. Le molecole di DNA vengono separate a una particolare temperatura, a seconda del contenuto di legami idrogeno della catena complementare (ricca di temperatura di fusione regionale di GC) e della gravità della base adiacente.

Metodo DGGE

Vantaggi

1, quasi tutte le mutazioni

2 può essere rilevato e le molecole mutanti possono essere intatte Le molecole portatrici della Terra vengono analizzate separatamente per ulteriori analisi

3, non c'è bisogno di segnare

4, solo un passaggio nell'elettroforesi

5, può essere utilizzato senza DNA genomico amplificato

6 può rilevare le modifiche del DNA

svantaggio della metilazione

2, è necessario eseguire pre-esperimenti che richiedono costose "stecche GC"

3, che non può determinare la mutazione nella posizione del frammento di DNA

4, è necessario utilizzare il gel gradiente contenente la sostanza tossica formammide

5, il limite della dimensione del frammento di DNA è limitato a 100-500 bp